研之有理|低分子量肝素产品生物样本分析探讨

万邦医药分析测试中心在复杂基质样本生物分析技术领域已经深耕了17年，具备了卓越的技术实力和丰富的实践经验，包括在低分子量肝素类领域已完成抗Xa 因子、抗Ⅱa 因子活性分析方法的方法验证。

分析测试中心拥有符合中美双报要求的大小分子生物样本检测平台，严格的质量管理体系以及一套先进的生物样本分析设备，能够满足各种复杂的生物样本分析需求；已经完成了超过500项的生物样本分析实验，检测了超过90万支样本。我们接受了国家局的20多次核查，并成功获得了40多次免核查的认可。专业高效的生物样本分析团队，将为您提供药代动力学生物分析服务、免疫原性生物分析服务、药效学和生物标志物研究等服务，诚挚欢迎全国各地的朋友前来合作交流。

 低分子肝素（Low Molecular Weight Heparin，LMWH）主要用于治疗急性静脉血栓和急性冠脉综合症(心绞痛、心肌梗塞等)，同时，在妇产科、生殖科等科室的抗凝血辅助治疗中的作用日益突显。低分子肝素因分子量小、副作用少、抗凝效果好，逐步成为临床治疗的优选。随着人口老龄化，心血管患病人数增加等原因，使得中国肝素类药物市场前景广阔。临床上常用的低分子量肝素（LMWH）产品有依诺肝素钠、达肝素钠、那屈肝素钙、帕肝素钠和汀肝素钠等。但因LMWH体内剂量与PK关系尚未阐明，且LMWH为成分复杂的混合物，所以无法以药代动力学为生物等效性评价的终点指标，需进行人体药效学生物等效性研究。同时，FDA 通过个药指南（依诺肝素钠、达肝素钠）制定LMWH仿制产品的5 项评价标准，其中第5项为使用抗Xa 因子、抗Ⅱa 因子活性作为人体内PD终点生物等效性研究的检测指标。因此，生物样本中抗Xa因子、抗Ⅱa因子活性是LMWH仿制产品等效性评价的重要依据。

抗Xa 因子、抗Ⅱa 因子活性的生物分析方法一般使用二步显色法（2 Stages Heparin Assay），其原理是抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）与肝素结合后，对血浆中凝血丝氨酸蛋白酶（包括Ⅱa因子、Xa因子）的抑制作用会增加（也是肝素的抗凝作用机制）。在AT-Ⅲ、凝血因子（Ⅱa或Xa）过量条件下，肝素与AT－Ⅲ结合后，再结合凝血因子，只有未被结合的凝血因子才能发挥水解活性，将显色底物（对硝基苯胺，pNA）从特异性底物中释放出来。未被结合的凝血因子与肝素浓度负相关，最终测定的显色底物吸光值与肝素浓度呈负相关。

在实践中，该类产品的生物分析主要参照配体结合分析的相关要求，如9012《生物样品定量分析方法验证指导原则》，ICH M10 等。方法学验证中主要考察项目包括准确度与精密度（包括批内考察、批间考察）、选择性（健康人基质、溶血基质等）、平行性、定量范围、稀释线性和钩状效应、稳定性等。以下简述六种方法验证及样本分析的主要关注点：

（一）该体系显色较快，须严格控制每步孵育时间及孵育温度，在操作时用计时器精确到秒，力求优异的实验结果。

（二）稳定性数据是方法稳定的重要支柱，全面验证标准品/受试制剂/参比制剂在各条件下的稳定性以证明待测物的稳定性及方法的耐用性。其验证项包括：①储备液稳定性；②全血稳定性（不同温度）；③血浆样本稳定性（冻融循环、不同温度）；④样品前处理过程中的稳定性；⑤处理后样品稳定性（不同储存条件）。因涉及到标准品、参比制剂与受试制剂，故稳定性样本是一般项目的3倍，复杂且庞大，需要实验人员逻辑清晰，步步谨慎。

（三）在以发色底物法测定抗Ⅱa/Xa活性中，生物样本不同程度的溶血会对活性检测有不同程度的影响，使检测结果出现偏差。因此，在方法学验证时对血浆样品不同程度的溶血情况进行考察，并拍照留档为后期试验提供数据支持，为临床机构和分析测试中心提供判断标准。

（四）血样的采集与处理也可能会影响血浆中抗Xa因子、抗Ⅱa因子的活性，因此，采血条件、抗凝剂种类及浓度、采血后抗凝管的混匀操作、允许的离心前放置条件（时间、温度） 、离心条件（时间、温度、速度） 均须进行提前规定，并且与分析方法验证考察时使用的条件一致。

（五）因溶血、脂血、黄疸等样本均可能干扰抗Xa活性的测定。我们从源头控制轻柔采血、细心处理样本，尽量避免溶血。同时建立双方统一的溶血程度判断标准并记录，在样本交接时的溶血状态确认与记录。

（六）肝素类产品的生物样品分析通常会使用微孔板，将每个板作为独立的分析批，使用独立的校准曲线和质控样品。同一例受试者的全部样品尽可能分布在同一分析批以减少结果的变异，如果一块分析板无法包括全部样品，分析计划中应规定同一例受试者样品在分析批间的分布方案。板位信息、读板值等原始数据均应完整保存，并完整汇报。

目前FDA和EMA对等效性评价指标有所差异，主要集中在是否将抗Ⅱa 因子活性作为主要等效依据以及对等效性的判断标准。NMPA建议将抗Xa因子活性作为主要PD等效性评价依据、抗Ⅱa因子活性作为支持性依据，但对分子链相对较长的LMWH产品需要同样考虑评价抗Ⅱa 因子活性。因此，在LMWH 生物样本分析中，须同时检测抗Xa 因子、抗Ⅱa 因子活性，并在总结报告中汇报。

参考文献：

[1]Lijin Yu, Xin Guo, Sujie Jia, Yuanyuan Xiang, Zhigang Ding & Ren Guo (2018) Pharmacodynamic properties and bioequivalence of dalteparin sodium subcutaneous injection in healthy Chinese male subjects, Xenobiotica, 48：4, 376-381, DOI：10.1080/00498254.2017.1316021

[2]C. Gadiko, S. K. Tippabhotla, S. Thota, M. Nakkawar, R. Cheerla, M.R. Betha& V. Vobalaboina (2013) Bioequivalence study of two subcutaneous formulations of dalteparin：randomized, single-dose, two-sequence, two-period, cross-over study in healthy volunteers, Journal of Drug Assessment, 2：1, 21-29, DOI： 10.3109/21556660.2013.781504

[3]陈一飞,王莹,张琼光等.低分子量肝素产品生物样本分析关注点讨论[J].中国临床药理学杂志,2022,38(24)：3045-3048.DOI：10.13699/j.cnki.1001-6821.2022.24.024.

[4]陈立勋,李丽,韩鸿璨等.低分子量肝素注射液人体药效学生物等效性研究一般考虑[J].中国临床药理学杂志,2018,34(23)：2791-2795.DOI：10.13699/j.cnki.1001-6821.2018.23.031.

[5]陈立勋,李丽,韩鸿璨等.从监管视角的差异认识低分子肝素注射剂仿制的技术要求[J].中国临床药理学杂志,2018,34(23)：2796-2800.DOI：10.13699/j.cnki.1001-6821.2018.23.032.