【万邦研发小助手2020 026】色谱生物分析过程中内标的选择及其响应评估

内标，在生物样品分析中扮演着重要的角色：补偿待测分析物在样品处理和检测过程中的变异。选择合适的内标，对生物分析结果的准确性起着至关重要的作用。同时，内标响应的变异也提示着生物分析过程中可能存在的各种问题。本文将从内标的选择和内标变异的影响分析，聊聊LC-MS/MS法生物分析中关于内标的那些事儿！

合适的内标，一般具备以下特征：

1、与待测分析物具有相似的理化性质、相近的色谱保留；

2、与待测分析物或可能的干扰物具有足够的质谱分离度。

常见的内标有：稳定同位素内标（SIL-IS）和结构类似物内标。

稳定同位素内标：

应该与待测物具有足够的分子质量差异，避免由于同位素分布造成的交叉干扰，如，内标的分子量最好比待测物分子量高1%或者4~5个质量单位；

同位素的标记位置应该稳定，避免在处理和检测过程中发生同位素交换而造成干扰。

结构类似物内标：

最好与待测分析物具有相同的关键化学结构和官能团，相似的分子大小和理化性质（LogD值和PKa等）。结构和性质的差异，将导致提取回收率和离子化效率的差异。

内标可以在样品处理、色谱分离和质谱检测三个阶段追踪分析物，补偿过程中产生的变异。因此内标加入的时间，越早越好，一般是在样品处理时加样后的第一步加入内标。

内标加入后需要充分混匀。

内标的加入量应考虑多个因素，如分析物和内标之间交叉干扰的大小，方法的灵敏度，基质效应的大小，内标预期浓度内的线性响应等。

一般情况下，建议使用较高的内标浓度，可以改善标准曲线的线性，并与高浓度样品相匹配，减少分析未知样品时潜在的系统误差。

方法允许的情况下，建议使用相对大一点的加样体积（50μL或者更多），保证加样的精密度，同时肉眼可观测到是否有内标加样错误。

一般来说，内标对待测分析物的追踪能力可以从标准曲线的线性度，准确度和精密度，回收率和基质效应的结果来评价。内标应与待测物具有相似的基质效应和回收率。

内标响应的波动是不可避免的，但是过大的波动可能预示着分析结果的可靠性和方法的有效性。因此在样品分析过程中，需要对内标响应变异进行监控和检查。常见的方法如下图：

一般内标响应变异分为：

分散变异（个别变异）：

同一个分析批中一个或多个零散的样品的内标响应显著大于或小于其他样品的内标响应，常见原因是样品处理错误或者仪器错误造成，如内标加样错误，进样有气泡等。

通常可以在SOP中规定未知样品可接受的内标响应上下限（例如已知样品响应均值的50%~150%），对于超限的个别样品应进行复测。

系统性变异（趋势性变异）：同一个分析批中，内标响应在某一段样品中呈趋势性降低或减少，或者部分样品内标响应明显低于或高于其他样品，常见原因如样品基质的特殊性造成干扰，系统问题造成响应飘移等。

系统性变异应进行全面的原因和影响分析。一般质控样品在分析批中应该均匀散落分布，如果内标响应异常只出现在未知样品中，通常是未知样品相关的原因；

如果内标响应异常同时出现在已知样品（校正和质控样品）和未知样品中，通常和样品处理以及仪器设备故障相关。

内标响应变化的常见模式和原因，以及对分析结果准确度的影响如下：

如果内标加样准确并且充分混合，之后样品处理转移过程中产生的误差或不一致的进样体积等原因引起内标响应波动，只要响应的灵敏度满足要求，通常对测定结果没有影响。

为进一步确认内标响应变异的影响，常见的处理方式有：

1、样品重新分析

如果怀疑原因为系统未平衡好，在排除进样器或者系统故障等原因后，待系统平衡好后将分析批重新进样；

如果怀疑原因为样品处理不当，如未混匀，移液器故障等，应重新处理这些样品。

2、稀释复测

对于仅仅是某一个或者某一批受试者样品的内标响应变异大（受试者特殊基质差异或者代谢物、同服药物干扰等原因造成），可以用已知样品的空白基质对全部异常样品或者选取不同浓度的样品进行稀释测定，应确保稀释后的样品内标响应与已知样品一致。

如果稀释后的测定结果与稀释前结果一致（偏差在±20%以内），说明内标能够很好的追踪基质的影响，内标的变异对最终测定结果无明显影响；

如果稀释后的测定结果与稀释前结果不一致（偏差大于±20%），需要进一步调查分析，可能最终会导致调整或重新开发分析方法；

但此方法的前提是，稀释后的样品浓度依然能够在线性范围内。

3、使用受试者基质配制质控样品

如果原因是基质差异，也可以通过用空白的受试者基质（给药前零点样本）配制质控样品，测定这些质控样品的浓度。如果这些质控样品与受试者采集的样品内标响应一致，且这些质控样品的测定结果准确度偏差在±15%以内，则可以认为基质差异造成的内标变异对最终结果没有产生影响。

4、标准加入法

对于样品浓度太低不能通过稀释复测的方法进行调查的情况，可以考虑通过在这些样品中加入不同浓度的待测分析物和同一浓度的内标进行处理分析。根据加入待测分析物的已知浓度和对应的响应绘制浓度-响应曲线，通过外推的截距计算样品的浓度。

如果标准加入法测得的浓度与初始测定浓度一致，说明内标的变异对测定结果没有影响。

此方法需要较多的待测样品，而且需要消耗很多时间，对于样本量大的样品不太适用。

另外，如果内标响应波动大的样品，在ISR中内标响应正常，并且测定结果与初始测定结果一致，也可以说明初始的内标变异没有对测定结果产生影响。但是如果在方法学验证过程中就已经发现内标响应波动较大，可能提示方法的耐用性还需要提高，还需要进一步优化系统或方法。

总之，内标在保证LC-MS/MS定量分析的准确和方法耐用性方面起着非常重要的作用。应尽可能选择SIL-IS，特别是13C和15N标记的，因为这些内标可以抵消内标变异产生的很多影响，特别是基质差异造成的影响。样品分析过程中，需要关注每个分析批的内标响应波动情况。同样的变异趋势可能由不同的原因造成，应充分调查分析内标变异的原因，必要时可对相应的样品重新分析。有时即使内标响应异常，如果有证据表明内标依然能够追踪分析物，分析物/内标响应比值没有受到影响，可以接受响应异常的结果。

参考来源：

1、Evaluation of Internal Standard Responses During Chromatographic Bioanalysis: Questions and Answers，FDA

2、Buonarati MH，Schoener D. Investigations beyond standard operating procedure on internal standard response[J]. Bioanalysis，2019，0187

3、Li WK，Zhang J，Francis L.S.Tse. Handbook of LC-MS Bioanalysis: Best Practices, Experimental Protocols，and Regulations，First Edition，John Wiley & Sons, Inc.

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